Стр. 8
| Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 | Стр.5 | Стр.6 | Стр.7 | Стр.8 | Стр.9 | Стр.10 | Стр.11 | Стр.12 | Стр.13 | Стр.14 | Стр.15 | Стр.16 |
неудовлетворительно. Толстые участки содержат больше лимфоцитов,
тонкие - больше моноцитов и сегментоядерных клеток. Для
доброкачественного исследования морфологии клеток большое значение
имеет правильная его фиксация и окраска.
Источники ошибок
Правильная фиксация мазка придает стойкость форменным элементам
крови по отношению к содержащейся в красках воде, которая без
фиксации мазка гемолизирует эритроциты и изменяет строение
лейкоцитов. Фиксация мазка, вызывая коагуляцию белка, прикрепляет
препарат к стеклу. В качестве фиксаторов предложены: метиловый
спирт, этиловый спирт, смесь Никифорова, состоящая из равных частей
этилового спирта и серного эфира. Лучшим фиксатором является
метиловый спирт. Недостаточная фиксация мазка дает слабую окраску
нейтрофильной зернистости лейкоцитов и ведет к некачественной
окраске клеток.
Качественная окраска мазка позволяет правильно дифференцировать
клетки крови и их структуру при микроскопическом исследовании. При
применении любой методики окрашивания мазка крови важно точно
соблюдать методические правила приготовления растворов и временные
промежутки в течение процесса окрашивания. При приготовлении
растворов необходимо учитывать рН воды; она должна быть нейтральной.
Партии красителя, существующие в продаже, имеют различную
интенсивность окраски. Это обязывает опытным путем установить
оптимальную концентрацию (разведение) и время окрашивания для
каждого флакона красителя, которые устанавливаются путем окрашивания
серии препаратов растворами с различной концентрацией красителя,
меняя длительность его воздействия.
Для контроля качества подсчета лейкоцитарной формулы в мазках
крови используют контрольные мазки. Их готовят из капиллярной крови
доноров и больных на предметных стеклах, выполняя требования к
правильному приготовлению мазков, фиксации и окрашиванию. Затем
контрольные мазки многократно просчитываются (не менее 20 раз) по
200 клеток (не менее 5 квалифицированных специалистов). Из
полученных данных статистически рассчитывают критерии определения
_
правильности подсчета мазка путем расчета Х и +-2S. Контрольные
образцы, нормальные и патологические, регулярно вводятся в поток
клинических образцов и с их помощью проверяют качество работы
каждого сотрудника лаборатории. Подсчет считается правильным, если
результаты подсчета клеток входят в рассчитанные контрольные границы
_
Х +-2S для каждого вида клеток крови.
Суспензия фиксированных эритроцитов
Фиксация эритроцитов приводит к физико-химическим изменениям в
мембране эритроцитов, что предохраняет клетки от лизиса. В качестве
фиксирующего материала предложены формальдегид, танин,
глутаральдегид, ледяная уксусная кислота. Наибольшее распространение
получила методика фиксации эритроцитов глутаральдегидом. После
фиксации размер клеток изменяется в течение первых 3-4 дней, затем
остается стабильным от нескольких месяцев до нескольких лет.
Методика приготовления
Кровь собирают в сосуд с антикоагулянтом ЭДТА (5 мг сухого ЭДТА
на 1 мл крови). Затем плазму трижды промывают изоосмотическим
фосфатным буфером. Для этого к собранной крови добавляют раствор
буфера в 2 раза больше объема крови и полученную суспензию
центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин. Промытые
эритроциты фиксируют 0,25% раствором глутаральдегида в фосфатном
буфере, который постепенно добавляют к эритроцитам в отношении 1:10
(кровь:фиксирующий раствор). Фиксация производится при комнатной
температуре в течение часа. Фиксированные эритроциты трижды
промывают дистиллированной водой и доводят до окончательного объема
водой или 12,5% раствором глицина. Затем добавляют 3 мл 1% раствора
азида натрия. Тщательно перемешивают на магнитной мешалке в течение
30 минут и разливают в стерильные стеклянные пузырьки по 2-5 мл.
Хранение проводят при Т 4°С. Перед использованием материал
перемешивают на магнитной мешалке в течение 10 минут. Срок хранения
- от 6 месяцев до 1 года.
Суспензию используют для контроля качества подсчета эритроцитов
автоматическим и камерным методами.
Приготовление изоосмотического фосфатного буфера
154 ммоль/л, рН7,4: 0,246 г однозамещенного фосфорнокислого
калия и 3,187 г двузамещенного фосфорнокислого калия трехводного
растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл.
Ограничения применения консервированной крови
и фиксированных клеток крови
1. Дефицитность крови.
2. Фиксированные эритроциты обладают большей вязкостью по
сравнению с кровью (прилипают к стенкам и не переходят в состояние
суспензии).
3. Фиксирование клеток изменяет их электрический заряд, что
влияет на правильность результатов при автоматическом подсчете
клеток.
4. Фиксированные клетки более ригидны, что затрудняет их
прохождение через отверстия анализатора и меняет амплитуду пульсовой
волны (при автоматическом подсчете).
5. В первые 3-5 дней происходит уменьшение объема фиксированных
эритроцитов, затем их размеры остаются стабильными в течение 6
месяцев.
6. Дефицитность реактивов (глутаральдегида и азида натрия).
Возможные ошибки при подсчете количества клеток крови
1. При взятии крови:
а) неправильный забор крови (выдавливание из пальца, сгустки,
гемолиз);
б) использование неточно откалиброванных пипеток;
в) неточное пипетирование и разведение крови;
г) недостаточно быстрый забор крови и размешивание ее с
реактивом для разведения.
2. При разведении:
а) неточное пипетирование реактива для разведения;
б) использование грязной посуды и пипеток;
в) использование неточно откалиброванных пипеток;
г) использование некачественного реактива для разведения,
вызывающего гемолиз эритроцитов.
3. При измерении:
а) несоблюдение правил подготовки счетной камеры;
б) несоблюдение временных промежутков при подсчете количества
эритроцитов в камере, необходимых для оседания клеток на сетку;
в) нетщательное перемешивание крови перед заполнением камеры;
г) подсчет клеток в недостаточном количестве квадратов и
несоблюдение правил подсчета;
д) использование неоткалиброванного прибора при автоматическом
подсчете клеток.
Метод сохранения мазков для многократного микроскопирования
К 0,5 мл клея БФ-6 прибавляют 3 мл абсолютного спирта, 3 мл
бутилового спирта и тщательно перемешивают до получения прозрачной
жидкости с желтоватым оттенком. Хранят в склянке с хорошо притертой
пробкой. На предметное стекло с мазком наносят пипеткой большую
каплю пленкообразующей смеси и, покачивая стекло, дают ей равномерно
растечься по его поверхности. Избыток смеси с края стекла удаляют и
препарат кладут на горизонтальную поверхность для высушивания. При
комнатной температуре пленка высыхает 15-20 минут. Для ускорения
сушки мазок можно поместить в термостат при 60°С.
X. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ИССЛЕДОВАНИЙ МОЧИ
Почки выделяют ценный материал для исследования - мочу,
микроскопический и химический анализ которой многое может рассказать
о состоянии организма. Исследование мочи принадлежит к числу
анализов, к которым чаше всего прибегает практический врач. Это
понятно, ибо правильная диагностическая оценка данных исследования
мочи помогает разобраться не только в почечной патологии, где
правильный диагноз часто совершенно невозможен без анализа мочи, но
также ориентирует его при ряде других заболеваний. Отсюда понятно,
что анализ мочи должен быть произведен у каждого больного.
Степень точности получаемых результатов исследований мочи, в
основном, зависит от квалификации лаборанта, используемого
оборудования, реактивов и методов исследования.
Для получения правильных и воспроизводимых результатов
исследования мочи используют контрольные материалы, близкие по
возможности к образцам мочи пациентов, и контрольные мазки для
контроля качества микроскопических исследований осадка мочи.
Концентрация исследуемых веществ в контрольном материале должна
соответствовать практической чувствительности используемого метода
исследования.
Контрольные материалы с высокими концентрациями веществ могут
давать положительные реакции даже с испорченными реактивами или
полосками с экспресс-тестами, а одной из важных задач контроля
исследования мочи как раз и является выявление даже незначительной
потери в чувствительности исследуемого метода (особенно при
качественных пробах). В качестве контрольных материалов для контроля
химического состава мочи используют:
1. Водные растворы веществ.
2. Сливную мочу с консервантами.
3. Искусственные растворы мочи с добавками веществ, исследуемых
в моче.
Способы приготовления контрольных материалов
Контрольные препараты для микроскопии осадков мочи должны
содержать встречающиеся в моче соли, полиморфные эпителиальные
клетки, различные виды цилиндров, лейкоциты, эритроциты,
болезнетворные и неболезнетворные бактерии, грибы, паразиты
животных. Кроме того, целесообразно иметь препараты с осадками мочи,
характерными для наиболее распространенных заболеваний.
Кроме использования контрольных материалов применяют метод
параллельных проб, смешанных и повторных проб (см.выше).
Водные растворы веществ с известным содержанием используются
для контроля качества исследований (определения или обнаружения)
химического состава мочи (например, раствор глюкозы, мочевины,
альбумина).
Приготовление слитой мочи
Слитая моча используется в качестве контрольного материала для
контроля качества исследований химического состава мочи.
1.1. Реактивы.
1. Слитая человеческая моча, 1 л.
2. ЭДТА, хч, 2,0 г.
3. Изопропиловый спирт, хч, 1 л.
4. Раствор тимола, 5 мл (100 г тимола растворяют в 1 л
изопропилового спирта).
Используются обычно применяемые в лаборатории методы для
качественного и количественного исследования химического состава
мочи.
1.2. Способ приготовления.
К 1 л свежей человеческой мочи добавляют 2 г
этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА) и при энергичном встряхивании
и перемешивании флакона приливают 5 мл раствора тимола. Через 2
недели мочу центрифугируют для удаления слизи и незначительного
количества мочевой кислоты. После такой обработки моча становится
прозрачной и почти не имеет запаха. Контрольный материал хранят при
комнатной температуре. Срок годности - несколько лет.
1.3. Приготовление контрольных растворов, имитирующих мочу.
Контрольный раствор № 1.
Применяется в качестве контрольного материала для контроля
качества исследований химического состава мочи.
1. Натрий хлористый ч, чда, хч.
2. D(+) - Глюкоза, безводная, ч, чда.
3. Мочевина ч, чда.
4. Ацетон ч, чда.
5. Цельная кровь с величиной гематокрита 0,40-0,45 л/л.
6. Белок сыворотки крови. Используют сыворотку пациента с
исследованным содержанием общего белка или контрольную сыворотку.
7. Хлороформ высокой степени очистки. Используют методы
качественного исследования химического состава мочи.
Способ приготовления
В круглодонную колбу вместимостью 2 л вносят 10 г хлористого
натрия, 10 г мочевины, 1 г глюкозы и 4 мл ацетона (табл.14).
Таблица 14
Перечень добавляемых веществ и их концентрация в конечном растворе
--------------------T-----------------T-----------------------------
¦ Добавляемое ¦ Концентрация вещества в
Вещество ¦ количество ¦ контрольном растворе
¦ вещества ¦
--------------------+-----------------+-----------------------------
NаСl 10,0 г -
Мочевина 10,0 г 83 ммоль/л
Глюкоза 1,0 г 2,775 ммоль/л
| Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 | Стр.5 | Стр.6 | Стр.7 | Стр.8 | Стр.9 | Стр.10 | Стр.11 | Стр.12 | Стр.13 | Стр.14 | Стр.15 | Стр.16 |
|