НАЙТИ ДОКУМЕНТ
Наказ № 1135 від 19.12.2006Про затвердження положень про відомчі заохочення
Текст документа по состоянию на 2 июля 2009 года
<< Назад |
<<< Главная страница
Стр. 2
інфікованих тест-вірусами клітин за ЦПД та за кількістю клітин з
вірусоспецифічними включеннями після фарбування акридиновим
оранжевим.
6. Методи визначення віруліцидної активності
дезінфікуючих засобів
Серед методів визначення віруліцидної активності
дезінфекційних засобів найбільш поширеними є суспензійний метод та
різні модифікації методу тест-об'єктів. Кожний з них має свої
переваги та недоліки, які обумовлюють коректність їх застосування
при проведенні випробувань.
Обов'язковою умовою випробувань є їх проведення в трьох
повторах. У разі обліку результатів за ЦПД при отриманні
негативних результатів в основному досліді здійснюють 2 додаткових
пасажування дослідного матеріалу.
Суспензійний метод:
дозволяє забезпечити контакт досліджуваного дезінфекційного
засобу з концентрованим вірусовмісним матеріалом у рідкому
середовищі;
надає можливість моделювання дезінфекції біологічних рідин
(варіант з білковим навантаженням);
відносно безпечний при виконанні для персоналу лабораторії;
не застосовується при відсутності прийнятних способів
припинення дії дезінфектанту після завершення експозиції з
вірусовмісною рідиною.
Метод тест-об'єктів:
застосовується при відсутності прийнятних способів припинення
дії дезінфектанту або миючого засобу;
дозволяє краще змоделювати ситуацію з використанням реальних
предметів;
дозволяє безпосередньо вивчати ефективність дезінфекції;
не дозволяє створення високого вірусного навантаження на
тест-об'єктах.
6.1. Приготування розчинів дезінфікуючих засобів та
нейтралізаторів
При проведенні досліджень суспензійним методом досліджуваний
дезінфекційний засіб розчиняють у стерильній дистильованій воді,
або змішують з відповідним об'ємом води так, щоб його кінцева
концентрація в розчині була в 2 рази більшою, ніж рекомендовано
в інструкції по застосуванню засобу. Це обумовлено тим, що при
проведенні випробувань розчин досліджуваного препарату змішується
з вірусовмісною рідиною у рівних співвідношеннях, при цьому його
концентрація зменшується в 2 рази, досягаючи рекомендованих для
практичного застосування значень.
Для запобігання прояву цитотоксичної дії дезінфектанту на
клітини культури, яка використовується для визначення залишкової
інфекційної активності тест-вірусу за його цитопатичною дією,
перед внесенням на моношар культури клітин дезінфекційний засіб
повинен бути нейтралізований.
Для нейтралізації дезінфекційних засобів використовують такі
речовини:
для галоїдовміщуючих препаратів, перекісних сполук як
нейтралізатор використовують 0,5-1,0% розчин гіпосульфіту натрію;
для альдегідів - 0,5-1,0% розчин аміаку чи бісульфіту натрію;
для кислот - 0,5% розчин їдкого натрію чи калію, або 0,5%
розчин бікарбонату натрію;
для лугів - 0,5-1,0% розчин оцтової кислоти;
для четвертинних амонієвих сполук, амфолітів - 0,2% розчин
сульфанолу в 10% розчині молока;
для препаратів з невідомим нейтралізатором, а також для
препаратів, що добре розчиняються у воді (фенольного ряду),
використовують дворазове промивання у воді.
Розчини нейтралізаторів стерилізують і зберігають за
відповідних умов.
6.2. Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів
суспензійним методом
Виконання дослідження. Змішують рівні об'єми вірусовмісної
рідини (з відповідним інфекційним титром тест-вірусу в ній) та
досліджуваного дезінфекційного засобу, кінцева концентрація якого
в розчині в 2 рази перевищує ту, що вказано в інструкції по
застосуванню. Ефективність дезінфектанту досліджують без білкового
навантаження та при його наявності, використовуючи певні
концентрації дезінфектанту та відповідні експозиції. При
випробуванні дезінфектантів, що призначені для обробки рук, час
експозиції в даному тесті становить 1 хвилину або 30 секунд, якщо
в інструкції виробником не передбачено інакше. Після завершення
експозиції до суміші вірус - дезінфектант додають рівну кількість
розчину нейтралізатору і витримують 5 хв., після чого готують
послідовні десятиразові серійні розведення одержаних дослідних
проб та контролю вірусу в підтримуючому живильному середовищі від
-1 -4
10 до 10 . Титр вірусу в них та залишкову інфекційність
визначають як описано в розділі 5.
Контролі: кожен дослід супроводжують наступними контролями:
1. Контроль клітинної культури - залишають незараженими по
4 пробірки або 10 лунок з клітинним моношаром протягом всього
терміну спостереження;
2. Контроль вірусу (замість дезінфектанту використовують
стерильну дистильовану воду);
3. Контроль вірусу у суміші з білковим навантаженням;
4. Контроль токсичності суміші дезінфектанту з
нейтралізатором;
5. Контроль повноти нейтралізації дезінфектанту.
Контроль дезінфікуючої дії (референс-дезінфектант):
паралельно до основного досліду виконують дослідження
формальдегіду при pH 7,0 без сироватки. Концентрація останнього
повинна бути 0,7 г/100 мл. Для виконання цього контролю одну
частину вірусовмісної рідини змішують з 4 частками розчину Хенксу
і 5 частками 1,4% розчину формальдегіду
Результат. Результат випробування віруліцидної дії
дезінфекційного засобу щодо відповідного тест-вірусу вважається
позитивним, якщо досягається зменшення інфекційного титру
тест-вірусу не менше ніж на 4,0 lg ТЦД50/мл у порівнянні
з контролем.
6.3. Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів
методом тест-об'єктів
6.3.1. Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів на
батистових тест-об'єктах
Підготовка батистових тест-об'єктів. Тест-об'єкти - це
шматочки батисту розміром (1 х 0,5 см), попередньо звільненого від
крохмалю. Вірусовмісну рідину для контамінації тест-об'єктів
готують як вказано у розділі 5. Батистові тест-об'єкти кладуть у
стерильну чашку Петрі і контамінують вірусовмісною рідиною,
додаючи її з розрахунку 0,05-0,1 мл рідини на кожний тест-об'єкт.
Всі тест-об'єкти добре змочуються. Через 20 хвилин зайву рідину
промокають стерильним фільтрувальним папером, а шматочки батисту
підсушують у термостаті при 37 град.C або в ексикаторі з хлористим
кальцієм протягом 30 хв. Готові тест-об'єкти повинні бути
використані в день приготування, для запобігання зменшенню
інфекційної активності вірусу під дією зовнішніх чинників.
Кількість вірусу на тест-об'єктах повинна бути максимально
можливою, що важливо для компенсування його втрати при наступній
обробці тест-об'єктів.
Виконання дослідження. При визначенні віруліцидних
властивостей препарату готують 3-5 концентрацій розчину на
дистильованій воді з розрахунку 1,0 мл розчину на кожний
тест-об'єкт (робочі розчини). У разі підтвердження випробувань
готують робочі розчини дезінфекційного засобу в таких
концентраціях: 1) кінцева концентрація дезінфектанту відповідає
зазначеній в інструкції; 2) кінцева концентрація препарату
в 2 рази перевищує зазначену в інструкції; 3) кінцева концентрація
препарату в 2 рази нижча за вказану в інструкції.
У робочі розчини занурюють підготовлені тест-об'єкти з
розрахунку 5 штук на кожну експозицію. Легким погойдуванням
ємності з розчином досягають повного змочування всіх
тест-об'єктів. Момент повного змочування тест-об'єктів вважають
початком досліду. Випробування проводять при кімнатній температурі
(18-24 град.C). Після закінчення заданих експозицій стерильним
охолодженим пінцетом чи петлею виймають по 5 тест-об'єктів і
занурюють їх у пробірку з 5 мл стерильного розчину нейтралізатора
на 5 хв. Після цього стерильною петлею тест-об'єкти переносять у
відповідні пробірки зі скляними кульками та 5 мл стерильного
фізіологічного розчину, які струшують протягом 10 хвилин.
Одержаною рідиною з кожної пробірки інфікують по 4 клітинні
моношари. Для цього у пробірки вносять по 0,8 мл підтримуючого
середовища та 0,2 мл рідини, одержаної після відмивання
тест-об'єктів. При використанні мікрометоду у лунки вносять
100 мкл підтримуючого середовища та 100 мкл рідини після
відмивання тест-об'єктів. Інфіковані клітини інкубують при
37 град.C, при мікрометоді - у CO інкубаторі впродовж 5-7 діб.
2
Щоденно спостерігають за розвитком ЦПД тест-вірусу, або визначають
наявність інфікованих клітин через 24 години після інфікування при
фарбуванні клітинних моношарів акридиновим оранжевим як описано у
розділі 5.
Якщо в клітинних культурах не спостерігається цитопатичного
ефекту, спричиненого тест-вірусом, то додатково роблять 2 пасажі.
При відсутності специфічної зміни в клітинних культурах
тест-віруси вважають повністю інактивованими. При оцінці
результатів за підрахунком кількості клітин після фарбування
акридиновим оранжевим, тест-вірус вважають повністю інактивованим,
за умов повної відсутності інфікованих клітин в досліджуваних
препаратах.
Контролі:
1. Контроль клітинної культури - залишають не зараженими по
4 пробірки (лунки) з моношаром клітинних культур і спостерігають
максимальний термін досліду. Через 24 години як у дослідних, так і
в контрольних пробірках змінюють підтримуюче середовище. Впродовж
спостереження підтримуюче середовище змінюють у залежності від
зміни pH.
2. Контроль вірусного навантаження при контамінації
тест-об'єктів - 5 штук заражених тест-об'єктів занурюють у
пробірку зі скляними кульками та 5 мл стерильного фізіологічного
розчину. Пробірки струшують впродовж 10 хвилин. Одержану рідину
використовують для інфікування клітинних культур.
3. Контроль збереження життєздатності вірусу - 5 штук
заражених тест-об'єктів занурюють у пробірку з розчином Хенкса,
витримують максимальну експозицію, після чого переносять на 5 хв.
у 5 мл нейтралізатора, а потім у 5 мл фізіологічного розчину, де
струшують зі скляними кульками 10 хв. та інфікують відповідною
дозою рідини, відмитої з тестів, 4 клітинні моношари. Для
з'ясування кількості збереженого вірусу проводять титрування.
4. Контроль повноти нейтралізації дезінфектанту - 5 штук
незаражених тест-об'єктів занурюють на максимальну експозицію
в 5 мл розчину дезінфектанту максимальної концентрації, після чого
переносять тест-об'єкти на 5 хв. у 5 мл розчину нейтралізатора,
потім - у 5 мл фізіологічного розчину. Струшують зі скляними
кульками протягом 10 хв. Вносять відповідну кількість рідини
в 4 пробірки (лунки) з моношаром клітинних культур. Висновок про
повноту нейтралізації дезінфектанту роблять на підставі
відсутності токсичної дії на культуру клітин протягом всього
періоду спостереження.
5. Контроль дезінфікуючої дії (референс-дезінфектант):
Паралельно основному досліду виконують дослідження дезінфікуючої
дії 0,7% розчину формальдегіду при pH 7,0 без сироватки. Для
виконання цього контролю одну частину вірусовмісної рідини
змішують з 4 частками розчину Хенкса 5 частками 1,4% розчину
формальдегіду.
Кожний дослід виконують тричі.
Результат. При виконанні сертифікаційних досліджень
дезінфекційний засіб вважається таким, що відповідає вимогам, якщо
він повністю інактивує інфекційну активність тест-вірусу при
використанні його за умов, зазначених в інструкції.
При виконанні скринінгових досліджень (пошуку нових
дезінфектантів) після встановлення наявності віруліцидних
властивостей у дезінфікуючого засобу, вивчають залежність
ефективності його дії від концентрації діючої речовини, часу
впливу, температури, реакції середовища.
Вплив температури на активність дезінфікуючого засобу
вивчають при знезаражуванні контамінованих батистових
тест-об'єктів з використанням водяної бані.
При вивченні впливу pH середовища на активність препарату
готують ряд розведень з різними значеннями pH шляхом підкислення
0,1 N розчином оцтової чи іншої кислоти, чи підлужуванням 0,1 N
розчином лугу. Порядок проведення дослідів такий же, як з
інфікованими тест-об'єктами (описано вище).
6.3.2. Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів при
знезараженні посуду
При знезараженні посуду як тест-об'єкти використовують
тарілки, склянки, емальовані кружки, виделки, ложки.
Виконання дослідження. Чистий посуд (тарілки, склянки)
контамінують вірусовмісною рідиною, яку наносять піпеткою з
розрахунку 0,5 мл на 100 кв.см поверхні і рівномірно розподіляють
його стерильним скляним шпателем. Виделки і ложки занурюють у
вірусовмісну рідину на 1-2 хв. так, щоб ручки залишалися
незараженими. Заражений посуд підсушують при кімнатній
температурі. Після висихання посуд повністю занурюють
у дезінфікуючий розчин. Витрата розчину складає, приблизно, 2 л на
комплект посуду: чашка, блюдце, 2 тарілки, ложка, вилка, ніж.
Через визначені проміжки часу посуд витягають з дезінфікуючого
розчину і перевіряють ефективність знезаражування. Для цього
стерильними марлевими серветками розміром (3 х 3) см ретельно
протирають заражену частину кожного предмету. Серветки
нейтралізують у 5 мл нейтралізатора. Після чого вміщують їх у
стерильну широку пробірку з розчином Хенкса та скляними кульками і
відмивають струшуючи протягом 10 хв. Цією рідиною заражають
по 4 пробірки (лунки) з моношаром клітинної культури.
Контролі. Контролем є аналогічно контамінований посуд,
занурений на максимальну експозицію в стерильну або кип'ячену
водопровідну воду. Після чого з посуду беруть пробу як і в
досліді. Вірусне навантаження визначають титруванням.
Результат. При виконанні сертифікаційних досліджень
дезінфекційний засіб вважається таким, що відповідає вимогам, якщо
він повністю при зазначених концентраціях та експозиціях інактивує
інфекційну активність тест-вірусу.
При одержанні позитивного результату знезараження чистого
посуду переходять до знезараження посуду, забрудненого залишками
їжі. Для цього манну кашу, зварену на молоці і заправлену
вершковим маслом змішують з вірусовмісною рідиною з розрахунку 9 г
каші на 1 мл суспензії вірусу і наносять рівномірно на поверхню
посуду. Методика знезараження посуду і відбір проб виконуються
аналогічно тим, що описана для чистого посуду. Рідину після
відмивання серветок центрифугують при 1500 g протягом 10 хв.,
після чого надосад використовують для тестування у культурі
клітин.
Контролі. Контролем є аналогічно контамінований посуд,
занурений на максимальну експозицію в стерильну або кип'ячену
воду. Після чого з посуду беруть пробу як і в досліді. Для
з'ясування вірусного навантаження проби титрують.
Результат. При виконанні сертифікаційних досліджень
дезінфекційний засіб вважається таким, що відповідає вимогам, якщо
він повністю інактивує інфекційну активність тест-вірусу при
визначених концентраціях та експозиціях.
Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів при
знезараженні виробів медичного призначення
При знезараженні виробів медичного призначення, виготовлених
з різноманітного матеріалу (скла, металу, гуми і пластмаси),
штучно контамінованих вірусами, проводять дії, аналогічні щодо
знезараження посуду. Як білкове навантаження використовують
сироватку великої рогатої худоби. При проведенні знезараження
виробів необхідно звернути увагу на важкодоступні для
дезінфекційних розчинів місця обробки, що може спричинити
збільшення експозиції або концентрації дезінфекційного засобу.
Дезинфекцію ендоскопів проводити згідно з методичними вказівками
Методичні вказівки щодо очищення, дезінфекції та стерилізації
ендоскопів, а також медичного інструментарію до них (м. Київ,
2004 р.).
6.3.3. Визначення віруліцидної дії дезінфікуючих засобів при
знезараженні білизни
При знезараженні білизни враховують норму витрати розчину на
1 кг сухої білизни (при особливо небезпечних інфекціях витрата
розчину складає 5 л/кг, при інших - 1 л/кг), температуру розчину,
ступінь і характер забруднення білизни, вплив дезінфікуючого
розчину на міцність і фарбування білизни.
Контроль ефективності знезараження білизни дезінфікуючим
розчином проводять за допомогою батистових тест-об'єктів.
Виконання дослідження. Заражені і підсушені тест-об'єкти
кладуть у бязеві стерильні мішечки розміром (5 х 8) см по 5 штук у
кожний. Мішечки закривають у вигляді конверту, до кута пришивають
нитку довжиною близько 0,5 м.
Дезінфікуючий розчин готують перед дослідом на стерильній
дистильованій водопровідній воді як зазначено в інструкції.
Білизну (старі бязеві халати і рушники) занурюють у бак або
відро з дезінфекційним розчином послідовно, одну річ за іншою,
стежачи за тим, щоб між речами не утворилося повітряних прошарків,
що перешкоджають процесу дезінфекції. Одночасно між шарами білизни
розміщують (зверху, у середині і знизу) мішечки з зараженими
тест-об'єктами. Через визначені проміжки часу мішечки з
тест-об'єктами виймають одночасно з трьох шарів. Тест-об'єкти
достають з мішечка стерильним пінцетом, нейтралізують, промивають,
і рідиною, відмитою з тест-об'єктів, інфікують по 4 клітинні
моношари чутливої культури клітин у пробірках або лунках планшета.
Контролі. У контрольних дослідах білизну занурюють у
стерильну або кип'ячену водопровідну воду. Мішечки з
тест-об'єктами закладають так само, як у досліді.
Результат. Результат вважають позитивним при повній
інактивації тест-вірусів на всіх досліджуваних тест-об'єктах.
При одержанні позитивного результату у дослідах по
знезараженню чистої білизни, контамінованої вірусом, переходять до
дослідів по знезараженню забрудненої білизни.
При підготовці тест-об'єктів для дослідження віруліцидної
активності дезінфекційних засобів по відношенню до вірусів з
повітряно-крапельним механізмом передачі, до 6 мл вірусовмісної
рідини додають 4 мл інактивованої сироватки великої рогатої
худоби. Цією сумішшю повністю змочують (контамінують)
тест-об'єкти.
При підготовці тест-об'єктів для дослідження віруліцидної
активності дезінфікуючих засобів по відношенню до поліс", аденота
ротавірусів до 6 мл вірусовмісної рідини додають 4 мл 40%
суспензії фекалій (8 г, попередньо простерилізованих
автоклавуванням при 1,5 атм протягом 30 хв., фекалій розтирають
у ступці з 20 мл води). Отриманою суспензією заражають
тест-об'єкти, підсушують і використовують у досліді.
Результат. Результат вважають позитивним при повній
інактивації тест-вірусів на всіх досліджуваних тест-об'єктах.
| Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 |
<< Назад |
<<< Главная страница
|
